Técnica para determinação de anticorpos anti-pneumococos:

1) Diluir os polissacarídeos 1,5,6,9 e 14 (concentração inicial de 10 mg/ml) a uma concentração de 10 mg/ml em tampão PBS 7,4. O polissacarídeo 3 (concentração inicial de 5 mg/ml) a uma concentração de 10 mg/ml em tampão PBS 7,4. Colocar 100 ml/poço da diluição nas placas de ELISA Maxisorp (Nunc-439454 ou 442404). Cobrir com filme plástico.

2) Incubar as placas a 37 °C por 5 horas e após esse período a 4°C até o dia seguinte.

3) Diluir as amostras (1/11) primeiramente em tampão BSA ( albumina bovina - Sigma A7030) 1% em PBS-Tween 20 0,1% contendo polissacáride C (50 mg/mL ). Deixar 30 minutos a temperatura ambiente.

#Poly C: 10 mg/ml (concentração inicial) diluir para 50mg/mL (1:200). Num volume de 3,8 ml de tampão (suficiente para diluição de 11 amostras) acrescentamos 19 ml de Poly C.

Diluição inicial (1:11)

Após os 30 minutos proceder às diluições finais: 1/220 para a curva padrão ("Pool" Pneumo) e amostra controle ("Pool" H) e 1/55 para as amostras testes (pré e pós vacinação).

Diluições finais:

"Pool Pneumo": "Pool" de soro de adultos vacinados
"Pool" H: "Pool"de soro de adultos não vacinados

4) Lavar as placas com PBS-Tween 20 0,1% por 3 vezes.

5) Nos poços iniciais, colocar 100 ml de amostra. Nos demais, 50 ml de tampão. Com a pipeta multicanal, retirar 50 ml do poço inicial e passar para o seguinte. Homogeneizar e passar novamente 50 ml para o seguinte e assim sucessivamente (diluição seriada). Desprezar ou últimos 50 ml. A curva padrão terá 7 diluições ( a partir de 1/220) e as amostras testadas 4 diluições ( a partir de 1/55).

6) Incubar a placa por 2 horas a temperatura ambiente.

7) Repetir o procedimento 4.

8) Adicionar o conjugado anti-IgG humana marcado com peroxidase (Hybridoma, USA, clone HP-6043), na diluição de 1:5000 no tampão de diluição (BSA 1% em PBS T 20 0,1%). A diluição sugerida é de 1/5000, porém é necessário uma titulação prévia do conjugado para uma correta padronização.

9) Incubar as placas por 1h30m a temperatura ambiente.

10) Repetir o procedimento 4.

11) Adicionar o substrato da enzima ( 100 ml por poço):
Preparação do substrato: 3 pastilhas de OPD 10 mg (ortofenilediamina -Sigma P-8287) dissolvida em 75 ml de tampão citrato-fosfato 0,1M pH 5,0 e 30 ml de peróxido de hidrogênio (H2O2). Volume suficiente para 6 placas.

12) Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos (escuro).

13) Bloquear a reação com ácido sulfúrico 2,5N (50 ml por poço).

14) Leitura em comprimento de onda de 492nm.

Polissacarideos:
Sorotipo 1 (tipo 1): código 161- X
Sorotipo 3 (tipo 3): código 169- X
Sorotipo 5 (tipo 5): código 177- X
Sorotipo 6B (tipo 26): código 225-X
Sorotipo 9V (tipo 68): código 253- X
Sorotipo 14 (tipo 14): código 197- X

Procedência: ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, Maryland, USA.

Polissacarídeo C (Ps-C):
Procedência: Statens Seruminstitut, Copenhage S., Denmark. Código 252.130.

Conjugado (anticorpo monoclonal de camundongo anti- IgG humana marcado com peroxidase):
Procedência: Hybridoma Reagent Laboratory. Baltimore, MD 21224 USA. Código HP 6043.