Técnica para determinação de anticorpos
anti-pneumococos:
1) Diluir os polissacarídeos 1,5,6,9 e 14 (concentração
inicial de 10 mg/ml) a uma concentração de 10 mg/ml em tampão
PBS 7,4. O polissacarídeo 3 (concentração inicial
de 5 mg/ml) a uma concentração de 10 mg/ml em tampão
PBS 7,4. Colocar 100 ml/poço da diluição nas placas
de ELISA Maxisorp (Nunc-439454 ou 442404). Cobrir com filme plástico.
2) Incubar as placas a 37 °C por 5 horas e após esse período
a 4°C até o dia seguinte.
3) Diluir as amostras (1/11) primeiramente em tampão BSA ( albumina
bovina - Sigma A7030) 1% em PBS-Tween 20 0,1% contendo polissacáride
C (50 mg/mL ). Deixar 30 minutos a temperatura ambiente.
#Poly C: 10 mg/ml (concentração inicial) diluir para 50mg/mL
(1:200). Num volume de 3,8 ml de tampão (suficiente para diluição
de 11 amostras) acrescentamos 19 ml de Poly C.
Diluição inicial (1:11)
Amostra |
Soro (ml) |
Tampão com Poly C (ml) |
Pré/Pós |
30 |
300 |
Após os 30 minutos proceder às diluições
finais: 1/220 para a curva padrão ("Pool" Pneumo) e amostra
controle ("Pool" H) e 1/55 para as amostras testes (pré
e pós vacinação).
Diluições finais:
Amostra |
Diluição(ml) |
Soro absorvido(ml) |
Tampão(ml) |
Padrão "Pool"Pneumo |
1/220 |
70 |
1330 |
Soro "Pool" H |
1/220 |
70 |
1330 |
Soro Pré/Pós |
1/55 |
330 |
1320 |
"Pool Pneumo": "Pool" de soro de adultos vacinados
"Pool" H: "Pool"de soro de adultos não
vacinados
4) Lavar as placas com PBS-Tween 20 0,1% por 3 vezes.
5) Nos poços iniciais, colocar 100 ml de amostra. Nos demais,
50 ml de tampão. Com a pipeta multicanal, retirar 50 ml do poço
inicial e passar para o seguinte. Homogeneizar e passar novamente 50 ml
para o seguinte e assim sucessivamente (diluição seriada).
Desprezar ou últimos 50 ml. A curva padrão terá 7
diluições ( a partir de 1/220) e as amostras testadas 4
diluições ( a partir de 1/55).
6) Incubar a placa por 2 horas a temperatura ambiente.
7) Repetir o procedimento 4.
8) Adicionar o conjugado anti-IgG humana marcado com peroxidase (Hybridoma,
USA, clone HP-6043), na diluição de 1:5000 no tampão
de diluição (BSA 1% em PBS T 20 0,1%). A diluição
sugerida é de 1/5000, porém é necessário uma
titulação prévia do conjugado para uma correta padronização.
9) Incubar as placas por 1h30m a temperatura ambiente.
10) Repetir o procedimento 4.
11) Adicionar o substrato da enzima ( 100 ml por poço):
Preparação do substrato: 3 pastilhas de OPD 10 mg (ortofenilediamina
-Sigma P-8287) dissolvida em 75 ml de tampão citrato-fosfato 0,1M
pH 5,0 e 30 ml de peróxido de hidrogênio (H2O2). Volume suficiente
para 6 placas.
12) Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos (escuro).
13) Bloquear a reação com ácido sulfúrico
2,5N (50 ml por poço).
14) Leitura em comprimento de onda de 492nm.
Polissacarideos:
Sorotipo 1 (tipo 1): código 161- X
Sorotipo 3 (tipo 3): código 169- X
Sorotipo 5 (tipo 5): código 177- X
Sorotipo 6B (tipo 26): código 225-X
Sorotipo 9V (tipo 68): código 253- X
Sorotipo 14 (tipo 14): código 197- X
Procedência: ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852,
Maryland, USA.
Polissacarídeo C (Ps-C):
Procedência: Statens Seruminstitut, Copenhage S., Denmark.
Código 252.130.
Conjugado (anticorpo monoclonal de camundongo anti- IgG humana marcado
com peroxidase):
Procedência: Hybridoma Reagent Laboratory. Baltimore, MD
21224 USA. Código HP 6043.
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